domingo, 22 de abril de 2012

PROBLEMAS ACTUALES Y PERSPECTIVAS FUTURAS

El objetivo de la proteómica cardiovascular es conocer las proteínas del miocito y del resto de los tipos celulares de este sistema e identificar su función, para así poder entender su papel en los procesos patológicos. En el momento actual se está acumulando un gran número de datos (tabla 2), con nuevas proteínas no implicadas previamente en los procesos patológicos, aunque todavía no existe una integración fisiopatológica de tales datos. Es más, no está estudiado el proteoma de las células involucradas en una enfermedad tan altamente prevalente como es la aterosclerosis78. El conocimiento de las proteínas de las células que integran la placa aterosclerótica y de las células circulantes, como los monocitos y las plaquetas, que interaccionan con ellas, podría proporcionar una nueva visión molecular de este proceso. De este modo, es probable que varias de estas proteínas pudieran constituirse en nuevas dianas terapéuticas en un futuro inmediato. Es más, las variaciones del patrón proteico en suero o en células circulantes en esta enfermedad tendrían probablemente un valor pronóstico mucho mayor que el análisis aislado de una sola proteína, como es el caso de la proteína C reactiva79. La reciente aparición de la quimiogenómica, que integra la bioinformática y la química combinatorial, se perfila como una potente metodología para generar nuevos fármacos a partir de los datos proteómicos y genómicos80.




A pesar de los grandes avances técnicos realizados en los últimos años, persiste una serie de problemas. Probablemente, el fundamental es la identificación de proteínas, que sigue siendo un proceso lento. La aparición de nuevos espectrómetros, altamente automatizados, como los denominados TOF-TOF, que proporcionan masas con gran exactitud y generan secuencias de los péptidos, así como la introducción de nuevos buscadores de Internet, basados en algoritmos complejos, pueden acelerar y mejorar estos procesos en un futuro próximo. Las bases de datos de proteínas son cada vez más completas y con menos errores, lo que redundará en una mayor fiabilidad en las identificaciones. La cuantificación de proteínas en los geles 2-D es otro aspecto que necesita mejorarse. Se han descrito nuevas sondas fluorescentes, para el marcaje de las proteínas en muestras control (en verde) y patológicas (en rojo), que facilitan la comparación de los niveles de expresión, al aplicar ambas muestras en un único gel y detectar las proteínas a cada longitud de onda (método DIGE)81. Han aparecido métodos similares, como el ICAT82,83, aplicables cuando la separación de proteínas se lleva a cabo por HPLC. El estudio de los distintos subproteomas va a proporcionar una enorme expansión del número de proteínas conocidas actuales y de conexiones e interacciones en multitud de sistemas intracelulares, de señalización, regulación, localización, etc. Por tanto, a pesar de los problemas, la proteómica posee un enorme potencial de futuro84.
Uno de los elementos que puede aportar mayor luz próximamente en la enfermedad cardiovascular es la comparación de los datos genómicos a partir de los chips de ADN85-96, con los proteómicos, analizando la correlación o no, entre los genes, las proteínas expresadas y sus modificaciones postraduccionales. Los primeros datos comparativos han comenzado a conocerse97, pero su descripción queda fuera de los límites de este trabajo.

Perfil proteico de la miocardiopatía dilatada

Las miocardiopatías han sido un objetivo preferente en los estudios proteómicos del área cardiovascular, tanto en tejidos humanos como bovino y canino43,45,51,54,61-63. La miocardiopatía dilatada (MCD) es la causa más frecuente de trasplante cardíaco, y se conoce que cada año se presenta en 5-8 de cada 100.000 personas64. Sin embargo, su etiología es desconocida, aunque se ha asociado a diversos factores, particularmente genéticos31,32,65-67. Los geles
 2-D de biopsias humanas en esta enfermedad revelan un menor nivel de expresión en 88 proteínas en comparación con el perfil de expresión de muestras con cardiopatía isquémica48,49. Entre ellas destaca la desmina, ATP sintasa, creatincinasa, la cadena ligera 2 de la miosina y varios miembros de la familia de heat shock proteins (HSP-60 y 70)50-52

Análisis de subproteomas cardíacos


Este tipo de estrategia experimental se centra en el estudio de sólo una parte del proteoma total, de un subproteoma concreto. Suele utilizarse cuando un mecanismo molecular es parcialmente conocido y se han identificado algunas de las proteínas participantes, pero no todas. Uno de los ejemplos más notables fue el uso de anticuerpos monoclonales frente a la proteincinasa C (PKC), para coinmunoprecipitar todas aquellas proteínas implicadas en las cascadas de señalización de la PKC y analizarlas por 2-D e identificarlas por MS. De manera que pudo identificarse 36 proteínas que se asocian físicamente con la PKCε durante el «precondicionamiento» miocárdico70. Se habían acumulado datos que indicaban que la activación de la PKCε era un hecho esencial en el desarrollo del efecto cardioprotector del precondicionamiento isquémico, pero se desconocía su mecanismo molecular. El análisis proteómico ha puesto de manifiesto la participación de proteínas estructurales y del citoesqueleto (α -actina, prohibitina, villina, desmina, lap-2, etc.), proteínas de señalización (SRC tirosincinasa, LCK tirosincinasa, JNK1, JNK2, ERK1, ERK2, etc.) y proteínas de respuesta al estrés (iNOS, eNOS, COX-2, HSP-70, HSP-27, cristalin αβ , etc.) en este fenómeno. Además, se comprobó que la cardioprotección mediada por la PKCε estaba asociada no sólo con unas concentraciones alteradas de las proteínas antes citadas, sino también con modificaciones postraduccionales en 23 de las 36 proteínas estudiadas, aunque no fueron estudiadas70. Sin embargo, un estudio posterior ha podido demostrar la presencia de fosforilaciones en la cadena ligera 1 de la miosina en miocitos ventriculares de conejo, donde el precondicionamiento se indujo farmacológicamente con adenosina71. Los estudios con la PKCε han llevado a formular la hipótesis del «módulo de señalización» como medio de explicar, a nivel molecular, la cardioprotección mediada por esta isoforma de la PKC72.
http://www.revespcardiol.org/pt/node/2023298

TABLA 2. Proteínas cardíacas identificadas mediante estudios proteómicos y su asociación con diversas enfermedades en humanos y en diversos modelos animales


Las diversas enfermedades cardiovasculares pueden estar reflejadas, colectiva o individualmente, en los proteomas del músculo cardíaco y en los de los diversos componentes del sistema cardiovascular, incluso las células musculares lisas, endoteliales y células circulantes . Por ejemplo, los mecanismos moleculares de la disfunción ventricular son desconocidos, pero es lógico pensar que existan alteraciones significativas en la expresión de genes y proteínas del miocardio que caractericen este proceso y condicionen su desarrollo y desenlace.
Bases de datos de geles bidimensionales y proteínas del corazón
Una herramienta imprescindible en el estudio del proteoma cardíaco es establecer una base de datos que contenga el conjunto de las proteínas del miocardio. Un primer paso ha sido la elaboración de bases de datos de los geles 2-D con el inventario de las manchas (proteínas) que han logrado separarse. Algunas de ellas se han identificado posteriormente por MS. 
Los primeros geles 2-D, con baja resolución, de proteínas de miocitos, al comienzo de la década de los noventa conseguían separar 200-250 manchas.


Espectrometría de masas


Una vez separadas y cuantificadas las proteínas por 2-D o por HPLC es preciso identificarlas. Esto se lleva a cabo con la MS, que es una técnica analítica que determina con alta sensibilidad y precisión las masas moleculares de compuestos químicos o biológicos. A partir de la masa pueden deducirse datos estructurales e identificar los compuestos18. En MS se requiere la conversión de los compuestos (en nuestro caso, proteínas y péptidos) en iones en fase gaseosa, utilizando diversos procedimientos. Los iones se separan en función de la relación de su masa (m) y su carga eléctrica (z) (m/z), utilizando un analizador de masas, y son captados con detectores de una gran sensibilidad18.
En proteómica se utilizan fundamentalmente dos tipos de espectrómetros de masas. En el llamado MALDI-TOF (MALDI, matrix assisted laser desortion ionization- time of flight)22 (fig. 6) la ionización se logra combinando la muestra (conjunto de péptidos) con compuestos orgánicos (denominado matriz), que cristalizan y que al someterse a un pulso (nanosegundos) de láser vaporizan los péptidos. Éstos se aceleran en un campo eléctrico (20-25 kV) y se envían a un tubo de vuelo (3 m), en cuyo extremo se sitúa el detector. Para un voltaje de aceleración dado (20-25 kV), el tiempo de vuelo (TOF), del orden de microsegundos, empleado en llegar al detector es proporcional a m/z. Así, las moléculas pequeñas vuelan más rápido que las mayores y se detectan en orden creciente de sus masas. El conjunto de las masas de los péptidos procedentes de una proteína dada proporciona una «huella peptídica» (fingerprinting) que permite compararla con las masas teóricas de los péptidos que se producirían al digerir las proteínas presentes en las bases de datos. Esta comparación permite identificar la proteína23-25

Fig. 6. Análisis por espectrometría de masas con MALDI-TOF del conjunto de péptidos generados por digestión con tripsina de una proteína. Los péptidos se vaporizan con un pulso de láser (ampliado en la parte inferior) y se aceleran con alto voltaje (HV) hacia el tubo de vuelo. El ordenador recoge los datos del detector y presenta el resultado o espectro de masas, en el que las masas (en realidad m/z) de los péptidos y su intensidad se muestran ordenados de menor a mayor. Cada proteína genera un espectro característico o «huella peptídica» que permite identificar la proteína en las bases de datos.
El segundo tipo de espectrómetro vaporiza la muestra (péptidos, proteínas) directamente de la fase líquida en la que está en disolución mediante un «electrospray» (ESI, electrospray ionization) o nebulizador26 (fig. 7), de modo que se dispersa la muestra en microgotas que contienen los péptidos ionizados. Es un mecanismo similar al de los nebulizadores utilizados en perfumería, siendo un campo eléctrico la fuerza dispersante. Además de determinar la masa de los péptidos, en estos aparatos (trampa iónica, Q-TOF) puede seleccionarse un péptido de una cierta masa y romperlo en una cámara de colisión en presencia de un gas. Los fragmentos resultantes (o iones «hijos») se envían al detector, y se obtienen sus masas, de las que puede adquirirse la secuencia del péptido. A partir de la secuencia de uno o más péptidos, la búsqueda e identificación de la proteína en las bases de datos es unívoca y con una fiabilidad muy superior a la que proporciona la «huella peptídica» obtenida con el MALDI-TOF27.

Fig. 7. Esquema de un espectrómetro de masas (triple cuadrúpolo) con un sistema de electrospray (ESI) para vaporizar la muestra. El disolvente de las microgotas que contienen los péptidos se elimina con una cortina de N2 y los péptidos se dirigen al analizador de masas mediante campos eléctricos. En la cámara de colisión pueden fragmentarse los péptidos y obtenerse el espectro de masas de los fragmentos, lo que permite deducir la secuencia del péptido

Cromatografía líquida multidimensional

La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) es otra opción para la separación y cuantificación de proteínas. Se trata de una técnica analítica que separa las moléculas en función del tipo de soporte (columna cromatográfica) que se utilice (cambio iónico, fase reversa, afinidad, etc.). La HPLC en tándem, de forma análoga a la 2-D, combina dos tipos diferentes de cromatografía mediante la conexión de dos columnas (fig. 5). Habitualmente la primera columna es de cambio iónico (separación por carga) y la segunda de fase reversa (separación por hidrofobicidad)16. Aunque este sistema permitiría la separación de mezclas de proteínas, se utiliza, por su mejor resultado, en la separación de péptidos. Por este motivo, una vez solubilizada una muestra celular o un tejido, el conjunto de las proteínas se digiere con una proteasa (habitualmente tripsina), y se produce una mezcla muy compleja de péptidos (miles), que se separan en la HPLC. Actualmente estos cromatógrafos utilizan columnas capilares (75-100 μ m de diámetro interno y 5-10 cm de longitud) que permiten analizar muy poca cantidad de muestra (picomoles, fentomoles o incluso menos) rápidamente. Así, por ejemplo, se consiguen identificar péptidos de proteínas presentes en muy baja concentración en la célula, que normalmente no se detectan en los geles 2-D. Además, la HPLC se puede conectar directamente a un espectrómetro de masas, lo que permite la identificación automatizada de miles de péptidos --­y, por tanto, las proteínas de las que proceden--­, según van eluyendo de la HPLC21.


Fig. 5. Esquema de la separación por cromatografía multidimensional del conjunto de péptidos producto de la digestión de las proteínas de una muestra (biopsia, células). SCX: columna cromatográfica 1 (separación por carga); RP: columna 2 (separación por hidrofobicidad). Los péptidos eluidos se analizan por espectrometría de masas, habitualmente por un sistema de electrospray (ESI) (véase figura 7), y se obtiene su secuencia. Con ella, los programas de búsqueda (p. ej., SEQuest) en las bases de datos identifican la proteína de la que procede el péptido.

Electroforesis bidimensional



La 2-D es una técnica de separación de proteínas que consiste en una sucesión de dos modalidades de electroforesis distintas realizadas sobre una misma muestra 15 . El tejido o células que se han de analizar se solubilizan en tampones que contienen agentes disociantes y detergentes que facilitan la separación posterior de cada proteína individual. La primera dimensión es un electroenfoque, en el que las proteínas se separan en función de su punto isoeléctrico (pI) a lo largo de un gradiente de pH (p. ej., pH 3-10), y la segunda es una electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de un detergente (PAGE-SDS), en la que la separación se produce en función de la masa molecular de las proteínas (fig. 4).

Proteómica y enfermedad cardiovascular


Con la descripción del genoma humano se ha abierto una nueva manera de estudiar y entender los fenómenos fisiopatológicos. El siglo XX nos permitió conocer multitud de componentes de la célula de modo individual. Sin embargo, el siglo XXI se inicia con un análisis global de los componentes celulares. Gracias al desarrollo de diversas tecnologías, como los chips de ADN, o la electroforesis bidimensional, entre otros, ahora puede estudiarse la expresión de miles de genes, o de las proteínas que codifican, en pocas horas.
Además, la genómica ha dado paso a la proteómica.
La mera enumeración de los genes no informa de las funciones celulares, pues ninguna célula los expresa todos
simultáneamente, sino que, dependiendo del tipo celular y de los estímulos que reciba, expresará una parte variable de su genoma. El resultado será el proteoma, es decir, un conjunto de proteínas que sí son las responsables de las funciones celulares en cada momento, y que es el objeto de estudio de la proteómica.
En proteómica cardiovascular ha comenzado a describirse el proteoma de las células cardíacas y algunas proteínas nuevas, no identificadas previamente, que están alteradas en distintas miocardiopatías. Estas proteínas están implicadas en la producción de energía, en respuesta al estrés, o pertenecen al proteasoma o al citoesqueleto y pueden ser potenciales marcadores de riesgo y constituir nuevas dianas terapeúticas en el futuro.
La quimiogenómica aparece como una reciente metodología que posibilita generar nuevos fármacos a partir de los datos genómicos y proteómicos.


sábado, 14 de abril de 2012

Proporcionando mayor claridad a las pruebas de PCR

Un uso más amplio está en el horizonte de este simple análisis de sangre para medir el riesgo cardíaco.

 No es fácil para medir la salud del corazón y las arterias. La presión arterial y el colesterol son buenos sustitutos, pero no son perfectos. Es por eso que los investigadores han explorado cientos de otras pruebas. El que tiene bordes más cercanos al uso generalizado es una prueba de sangre para la proteína C-reactiva (CRP). Un exceso de proteína C reactiva en la sangre indica el tipo de firme, bajo grado de inflamación que acompaña a la aterosclerosis que obstruye las arterias, un factor clave en la enfermedad cardiovascular. La prueba se llama la alta sensibilidad de la proteína C reactiva (PCR-us) o la prueba de PCR cardiaca. Se definen tres categorías de riesgo.

La proteína C reactiva y el riesgo cardiovascular

 CRP                                               nivel de riesgo cardiovascular 
Por debajo de 1 mg / dL                          Bajo
1.3 mg / dL                                              Moderado
Por encima de 3 mg / dL                          Alto


Bibliografía:
http://o.elobot.es/descubrir-riesgos-ocultos-del-corazon/proporcionando-mayor-claridad-a-las-pruebas-de-pcr

sábado, 7 de abril de 2012

Pruebas de confirmación para ECV

PROCEDIMIENTOS DE DIAGNÓSTICO CARDIOVASCULAR
El diagnóstico de las afecciones cardiovasculares incluye una amplia serie de procedimientos como el ECG y la ecocardiografía para valorar el tamaño y la forma del corazón, el análisis de las cavidades y la naturaleza de los campos pulmonares, especialmente la vascularización



Pruebas de tamizaje y screening para ECV

 

Utilización de la oximetría de pulso para el tamizaje de enfermedad congénita cardiaca
La medición de la oximetría de pulso fue una practica realizable con un mínimo de tiempo de enfermería y mejoró el diagnóstico de enfermedad cardíaca dependiente de ductus previo al alta de la maternidad.
Screening para Enfermedades Cardiovasculares 
Mediante control electrocardiográfico de rutina, así como también la realización de una prueba ergométrica y la determinación mediante Tomografía de depósitos de calcio en las arterias coronarias; pudiendo determinar, así, la presencia de estenosis de alguna arteria coronaria  

http://www.intramed.net/contenidover.asp?contenidoID=59320
http://uninga.net/verpost/Apuntes/4213/Screening-para-Enfermedades-Cardiovasculares--Medicina-Familiar--UBA.html

Enfermedades cardiovasculares

Las enfermedades cardiovasculares (ECV) y los accidentes vasculares cerebrales (AVC) suelen ser fenómenos agudos que se deben sobre todo a obstrucciones que impiden que la sangre fluya hacia el corazón o el cerebro. La causa más frecuente es la formación de depósitos de grasa en las paredes de los vasos sanguíneos que irrigan el corazón o el cerebro.
El principal objetivo de haber elegido enfermedades cardiacas como tema de investigacion es porque a más de ser una las principales causas de mortalidad en el país fue la causa de muerte de mi abuelo paterno.