Una vez separadas y cuantificadas las proteínas por 2-D o por HPLC es preciso identificarlas. Esto se lleva a cabo con la MS, que es una técnica analítica que determina con alta sensibilidad y precisión las masas moleculares de compuestos químicos o biológicos. A partir de la masa pueden deducirse datos estructurales e identificar los compuestos18. En MS se requiere la conversión de los compuestos (en nuestro caso, proteínas y péptidos) en iones en fase gaseosa, utilizando diversos procedimientos. Los iones se separan en función de la relación de su masa (m) y su carga eléctrica (z) (m/z), utilizando un analizador de masas, y son captados con detectores de una gran sensibilidad18.
En proteómica se utilizan fundamentalmente dos tipos de espectrómetros de masas. En el llamado MALDI-TOF (MALDI, matrix assisted laser desortion ionization- time of flight)22 (fig. 6) la ionización se logra combinando la muestra (conjunto de péptidos) con compuestos orgánicos (denominado matriz), que cristalizan y que al someterse a un pulso (nanosegundos) de láser vaporizan los péptidos. Éstos se aceleran en un campo eléctrico (20-25 kV) y se envían a un tubo de vuelo (3 m), en cuyo extremo se sitúa el detector. Para un voltaje de aceleración dado (20-25 kV), el tiempo de vuelo (TOF), del orden de microsegundos, empleado en llegar al detector es proporcional a m/z. Así, las moléculas pequeñas vuelan más rápido que las mayores y se detectan en orden creciente de sus masas. El conjunto de las masas de los péptidos procedentes de una proteína dada proporciona una «huella peptídica» (fingerprinting) que permite compararla con las masas teóricas de los péptidos que se producirían al digerir las proteínas presentes en las bases de datos. Esta comparación permite identificar la proteína23-25
Fig. 6. Análisis por espectrometría de masas con MALDI-TOF del conjunto de péptidos generados por digestión con tripsina de una proteína. Los péptidos se vaporizan con un pulso de láser (ampliado en la parte inferior) y se aceleran con alto voltaje (HV) hacia el tubo de vuelo. El ordenador recoge los datos del detector y presenta el resultado o espectro de masas, en el que las masas (en realidad m/z) de los péptidos y su intensidad se muestran ordenados de menor a mayor. Cada proteína genera un espectro característico o «huella peptídica» que permite identificar la proteína en las bases de datos.
El segundo tipo de espectrómetro vaporiza la muestra (péptidos, proteínas) directamente de la fase líquida en la que está en disolución mediante un «electrospray» (ESI, electrospray ionization) o nebulizador26 (fig. 7), de modo que se dispersa la muestra en microgotas que contienen los péptidos ionizados. Es un mecanismo similar al de los nebulizadores utilizados en perfumería, siendo un campo eléctrico la fuerza dispersante. Además de determinar la masa de los péptidos, en estos aparatos (trampa iónica, Q-TOF) puede seleccionarse un péptido de una cierta masa y romperlo en una cámara de colisión en presencia de un gas. Los fragmentos resultantes (o iones «hijos») se envían al detector, y se obtienen sus masas, de las que puede adquirirse la secuencia del péptido. A partir de la secuencia de uno o más péptidos, la búsqueda e identificación de la proteína en las bases de datos es unívoca y con una fiabilidad muy superior a la que proporciona la «huella peptídica» obtenida con el MALDI-TOF27.
Fig. 7. Esquema de un espectrómetro de masas (triple cuadrúpolo) con un sistema de electrospray (ESI) para vaporizar la muestra. El disolvente de las microgotas que contienen los péptidos se elimina con una cortina de N2 y los péptidos se dirigen al analizador de masas mediante campos eléctricos. En la cámara de colisión pueden fragmentarse los péptidos y obtenerse el espectro de masas de los fragmentos, lo que permite deducir la secuencia del péptido
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